Nanossistema biespecífico para mediar uma estratégia teranóstica combinada e multialvo para o carcinoma hepatocelular

O principal objetivo desta proposta é desenvolver um nanossistema híbrido lípido-polímero (NHLP) biespecífico, constituído por uma estrutura “core-shell” e contendo dois tipos de ligandos de direcionamento (GalNAc e F(ab')2 anti-CD133), por forma a ter capacidade de se ligar às células de carcinoma hepatocelular (CHC), incluindo às células estaminais cancerígenas (CECs), e para co-transportar um agente de imagem/sonofotossensibilizador (Clorina e6 (Ce6)) e dois fármacos anticancerígenos (selumetinib e sorafinib) para o tumor, com o propósito de mediar uma estratégia de teranóstica eficaz, que permitirá a identificação precisa do tecido neoplásico e a indução de uma forte atividade antitumoral, envolvendo a inibição de vias de sinalização associadas à hepatocarcinogenese, induzida pelo selumetinib e o sorafinib, assim como a produção de espécies reativas de oxigénio e a ativação do sistema imunitário, promovida pelo Ce6. Os objetivos específicos do presente projeto são: • Desenvolver NHLP direcionados para CHC, compostos por lipídios (POPC, Chol e DSPE-PEG2000), polímero (PLGA) e ligandos (GalNAc e F(ab')2 anti-CD133), carregados com Ce6, selumetinib e sorafinib, e preparados com várias razões molares dos diferentes componentes; e realizar a sua caracterização físico-química (composição, funcionalização, tamanho, polidispersividade, carga superficial, estabilidade, estrutura, morfologia, carregamento e liberação de fármacos, propriedades de imagem, e interação com o soro), uma vez que as propriedades físico-químicas são determinantes na eficácia dos nanossistemas. Espera-se produzir NHLP com propriedades adequadas para aplicação in vivo. • Avaliar e compreender os mecanismos envolvidos nas interações dos NHLP com células, quer com células tumorais, incluindo as CECs, quer com não tumorais, avaliando a citocompatibilidade, a ligação, a especificidade e a internalização. Em particular, iremos analisar detalhadamente o efeito da incorporação dos ligandos GalNAc e F(ab')2 anti-CD133 na formulação dos NHLP, uma vez que esta deve resultar em altos níveis de especificidade, ligação e internalização destes nanossistemas pelas células de CHC, incluindo as CECs. Além disso, espera-se obter NHLP altamente biocompatíveis. • Avaliar a atividade antitumoral das estratégias teranósticas combinadas (NHLP carregados com Ce6 e/ou com selumetinib e/ou com sorafinib) e das estratégias individuais, e esclarecer os mecanismos de morte celular subjacentes. Em particular, serão avaliados os efeitos dos fármacos em culturas celulares 2D de CHC e em sistemas multicelulares 3D, incluindo obtidos a partir de tecido tumoral de doentes de CHC (amostras cedidas pelo IPO Coimbra de acordo com o protocolo estabelecido) medindo a proliferação celular; atividade citotóxica; produção de espécies reativas de oxigénio (ROS); mecanismos de morte celular, envolvendo apoptose, necrose e autofagia; ciclo celular; migração e invasão celular; e níveis de mRNA e proteína dos alvos moleculares envolvidos na progressão tumoral. Espera-se que as estratégias antitumorais combinadas resultem num efeito de morte das células tumorais muito superior ao obtido com as estratégias individuais. A multifuncionalidade desta plataforma teranóstica permitirá resolver os principais desafios dos tratamentos convencionais e, portanto, contribuir para a geração de novas estratégias antitumorais mais eficazes e com menos efeitos secundários, resultando num elevado impacto socioeconómico.