Vesículas extracelulares modificadas para entrega de microRNAs na diabetes

O projeto REVERSE irá modificar vesículas extracelulares (VEs) com miRNAs capazes de protegerem as células ß da morte celular induzida por glucolipotoxicidade (GLT) e desenvolver um sistema capaz de entregar essas VEs modificadas de forma controlada in vivo. Para tal, delineámos os seguintes objetivos: Objetivo 1: Modificação de VEs com miRNAs protectores contra GLT Após testarmos 2080 miRNAs usando ensaios de alto rendimento, a equipa identificou 17 miRNAs que eram capazes de proteger as células ß da morte induzida por GLT. Assim, as VEs serão modificadas com os cinco miRNAs mais promissores e posteriormente essas VEs serão caracterizadas usando métodos previamente relatados por nós (quantificação do número de partículas, análise de marcadores clássicos e potenciais contaminantes, carga superficial antes e após modificação, estabilidade em solução e após congelação) (2,5). Objetivo 2: Avaliação in vitro das VEs modificadas com miRNAs Avaliaremos a capacidade das VEs modificadas com miRNAs para proteger as células ß humanas da morte celular induzida por GLT. Para isso, testaremos as VEs obtidas no Objetivo 1 em células ß e células controlo (e.g., fibroblastos). Em resumo, as células ß serão tratadas com as 5 formulações diferentes, e a sua internalização e o tráfego intracelular serão analisados utilizando técnicas reportadas por nós (VEs marcadas com fluorescência, marcadores para diferentes compartimentos intracelulares envolvidos no tráfego e microscopia confocal) (5). Simultaneamente, testaremos a capacidade das mesmas 5 formulações protegerem as células ß da morte celular induzida por GLT. Com base nos resultados obtidos, selecionaremos as 3 melhores formulações para os ensaios subsequentes. Objetivo 3: Desenvolvimento de uma plataforma baseada em hidrogel para libertação controlada de VEs modificadas com miRNAs Usaremos um hidrogel desenvolvido pela equipa para encapsular as VEs modificadas com miRNAs (3). Este sistema permitirá libertar, de forma controlada, as VEs (o perfil de libertação dependerá da concentração do hidrogel) evitando dessa forma o uso de múltiplas administrações in vivo. A acumulação de VEs no pâncreas de murganhos será avaliada usando VE marcadas com fluorescência e imagem não-invasiva. Para tal, iremos comparar a acumulação obtida usando o método clássico (injecção intraperitoneal) e comparar com o nosso sistema de libertação controlada (testaremos 3 concentrações de hidrogel diferentes). A melhor concentração será usada para avaliar o efeito terapêutico das VEs modificadas com miRNAs. Objetivo 4: Avaliação do efeito terapêutico das VEs modificadas com miRNAs num modelo de rato diabético Para avaliar o efeito terapêutico das VEs modificadas com miRNAs, utilizaremos um modelo bem estabelecido de diabetes tipo 2 (T2DM) (ratos ZDF). Este modelo recapitula características importantes da doença humana, nomeadamente obesidade, resistência à insulina, hiperglicemia e hiperlipidemia (6) . Os níveis basais de glucose serão medidos para determinar o estado hiperglicémico, e o teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT) será utilizado como leitura para avaliar a função das células ß. O tratamento será iniciado assim que os níveis de glucose no sangue atingirem valores indicativos de hiperglicemia . As 3 melhores formulações do objectivo 2 serão encapsuladas no hidrogel seleccionado no objectivo 3 e a sua capacidade de reverter a disfunção nas células ß avaliada.